定制载体存储

存储的交付时间为 10-15 个工作日，从存储当天开始算起（而非从我们收到载体那天算起）。一旦收到载体试样和填好的载体存储表，我们将指定一个开始日期。

您可以在我们的网站上您的账户中找到建置载体的定价信息。

如果您需要联系客户经理了解定价事宜，可以在电子商务中的“账户”下找到其联系信息。

应将载体 DNA 重悬于无核酸酶的 Tris-EDTA (TE) 缓冲液 (pH 8.0) 或 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 中。我们不建议在水中重悬。

如果在存储过程中发现意外问题，客户支持部将会立即通知您，并提供一个修改后的存储完成日期。

Twist 载体（序列和图谱）可以点击个人账户页面的“我的载体”选项卡查看。

请发送邮件至 customersupport@twistbioscience.com 联系我们。

我们使用专有的基于同源性的克隆方法来组装我们的克隆基因，因此限制位点对克隆并不重要，您在设计插入片段时也不需要考虑 Twist 的克隆设计。但如果您的插入位点位于两个限制性位点之间，请将这些位点作为载体骨架的一部分，以确保框架具备位点特性。

有两种使用限制性内切酶克隆的选择。

选择 1 - 在插入片段上加入限制性位点

包括插入序列两端的整个限制性内切酶位点。限制性内切酶位点将是计算机中插入片段的一部分。

当订购基因时，您必须在插入片段上加入限制性内切酶位点。在定制载体存储方案中，如果您在订单中排除了基因上的限制性内切酶位点，那么您的最终产品中将完全没有限制性内切酶位点。

选择 2 - 在载体上加入限制性位点

请勿在插入序列中包含限制性内切酶位点。在定制载体存储表的“载体 + 插入”框中加入每个完整的限制性内切酶位点。限制性内切酶位点将是计算机中载体的一部分。

当订购基因时，请勿在插入片段上加入限制性内切酶位点。在定制载体存储方案中，如果您在订单中添加了基因上的限制性内切酶位点，那么您的最终产品中将重复出现限制性内切酶位点。

将您的插入片段输入设计器并选择定制载体，然后从 Twist 网站下载最终的构建序列。

详情如下：

下订单时：

点击草稿页面的“下载序列”按钮，您将获得整个订单的插入片段、载体和最终构建序列的详细信息。

点击基因编辑器页面上的“下载构建体 (GenBank)”按钮，您将获得带有最终构建序列的 GenBank 注释文件。

下订单后：

从主页进入“订单和草稿”界面，然后单击“打开订单”。找到目标订单后，将显示订单信息。您可以点击“原始提交序列”按钮，下载包含最终序列的文件。

在应用程序上设计插入位点后，单击数字框旁边的“预览并添加”链接，以定位或序列的形式查看插入位点。查看插入位点并确定插入位点配置正确后，选择“同意插入位点”。插入位点的详细信息将在界面左侧的“插入位点”下显示为一行，您可以使用新的插入位点继续编辑草稿。然而，请注意，虽然每个定制载体可添加多个插入位点。但一次只能将一个插入片段克隆到载体中。

注：如果您希望在已录入我司系统的载体上新增一个插入位点，无需重新寄送载体材料，但需要联系客户支持部 customersupport@twistbioscience.com，因为此项变更需通过特殊申请表单完成系统重录。

带有一个插入位点的载体被视为一次存储事件。多个插入位点将产生多个存储事件。

第一个插入位点一次性交纳 500 美元的安装费用，后续同一个定制载体内每插入一个额外的位点，将交纳 250 美元的安装费用。

我们不采用基于限制酶的克隆技术。如果预计要在限制性酶切之后进行 DNA 连接，请勿在您的插入片段中加入任何额外的核苷酸。

在您下达克隆基因的订单时，我们会严格按您提供的插入序列进行合成。如果您确实包含了侧翼限制性酶位点，我们也会对其进行合成；不会切除额外的碱基对。一旦收到插入片段序列，就不会以任何方式对其进行处理。

如果您使用 Twist 或定制载体下达克隆基因订单，我们强烈建议您使用设计器中的“下载序列”按钮来仔细检查最终构建体的序列：

请注意，一旦下达了基因订单，我们就不能以任何方式修改序列——如果您发现您的构建体存在错误，请联系 customersupport@twistbioscience.com 寻求帮助。

请提供给我们至少 100 ul 浓度为 100 ng/ul 的 10 ug 载体 DNA。载体 DNA 数量不足将造成存储过程的延迟。

不可以，您必须将载体的完整序列一起发送至 Twist。此信息将用于序列质控和确认克隆策略。我们将对您的载体进行测序，并将其与您发送给我们的序列进行比较。两个序列结果之间的错误或不匹配可能会推迟载体的存储。

您需要上传 GenBank 格式的完整载体序列以及将送至 Twist 的质粒的完整序列。Twist 将对收到的载体进行测序，以确保序列匹配。若出现任何差异，都会延缓存储过程。

确保您的载体满足以下要求：

• 载体体积 ≥ 100 uL（质粒材料不得置于滤纸上提交）
• 载体浓度 ≥ 100 ng/uL
• 载体质量 10 ug
• 必须有细菌复制起点（非低拷贝）
• 必须为克隆群体
• 必须为环形
• 必须有抗生素耐药性标记
• 在插入位点的 40 bp 范围内，不得含有大于 9 bp 的均聚物/重复序列
• 重复：必须包含至少 40 bp 的独特序列，在插入位点的上游和下游无大于 19 bp 的直接或反向重复
• 最终基因产品中不得含有 ccdB
• 在插入位点 50 bp 的范围内，必须能够通过限制酶位点实现线性化
• 必须符合 BSL-1

抗生素耐药性：

质粒必须包含以下大肠杆菌抗生素耐药性标记之一标准浓度如下：

细胞系（大肠杆菌）       

• 生产中可用的细胞系        
• 类似于 DH10Beta 的克隆株   
• 类 Stbl3 菌株（可在 37°C 下生长）        

拷贝编号              

仅允许使用结构复制起点。

生长条件     

• 标准温度：37°C/30°C   
• 标准时间：过夜/24 小时         
• 接种的菌落在 LB-Lennox 上生长 16 小时/24 小时后，必须达到自动化适用大小。

如果我们发现载体骨架中插入/缺失超过 100 bp，我们会通知客户。如果在插入位点上游或下游有一个有 200 bp 的插入/缺失/突变，我们会通知客户。

Twist 将对送达的载体进行测序，但仅分析插入位点周围区域（插入位点任何一侧 200 bp 范围内），以确定所接收的定制载体存储表格中的载体参考序列与质控数据之间的差异。

如果序列不匹配，或与客户提供的载体参考序列相比存在大量缺失或插入 (>100 bp)，我们将会进行报告。请注意，目前我们未报告插入位点两侧 200 bp 以外的 SNP。

如果发现与载体参考序列存在任何差异，存储完成时间可能会延迟。