基因合成

There are no differences in regards to the manufacturing of your gene and there are no pros or cons regarding quality - it is merely preference.  Some customers prefer tubes to plates because it meets their storage needs.  Other customers prefer plates because they have a high throughput workflow. 对于 10 个或以上基因的订单，如果需要试管，将额外收取 50 美元的固定费用。

对于基因片段（无论是否有接头），您可以选择在每个片段的末端添加您自己的限制性位点，以便轻松地将片段克隆到您所选的载体中。

对于克隆基因，只需提交您希望我们克隆到载体骨架上的独有插入序列即可。我们使用专有的、基于同源性的克隆方法来组装我们的克隆基因，并为您设计和添加同源的突出位点序列，您在设计插入片段时无需受限于我们的克隆策略。

请注意，我们的克隆载体没有直接位于插入片段两侧的限制性位点。这使得设计具有充分的灵活性，因此您可以将所需的限制性位点附加到插入片段的两侧，以便在下游工作流程中使用。

我们的表达载体插入点由两个限制性位点表示——它们将完整地保留在您最终构建体插入序列的侧翼。我们建议客户通过单击设计器中的“下载序列”按钮来查看最终的构建体序列。制造订单一旦提交，就不能再以任何方式更改。

我们所有的克隆基因合成产品均经过 NGS 测序验证。

基因片段未经 NGS 验证。由于基因合成错误率较低，因此我们估计要获得置信度为 99% 的序列完美克隆，600、1200 或 1800 bp 的基因片段分别需要测序大约 3、4 或 6 个克隆。

Twist Bioscience 合成的 DNA 产品会经干燥处理，或重悬在 2 mL 微量离心管、96 孔板或 384 孔板中后运输。干燥的 DNA 在室温下运输，而重悬的 DNA 则在冷冻状态下运输。

• Twist recommends storing Dried DNA:
  • Room temperature for 3 months
  • 4° C for 12 months
  • -20° C for 24 months
  • -80° C for long term storage

• 重悬指南
  • Briefly centrifuge the tube or plate before opening and resuspend in nuclease free Tris-EDTA (TE) buffer, pH 8.0 or 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 to the desired concentration. A concentration of at least 10 ng/μL is recommended for the stock dilution. 制备分装的原液稀释液以及工作溶液，以降低污染的发生几率并减少冻融的次数。

• Resuspended DNA may arrive in:
  • 洗脱缓冲液（2 mM Tris-Cl，pH 8.5）
  • TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0，1 mM EDTA）
  • TE 缓冲液低 EDTA（10 mM Tris-Cl pH 8.0，0.1 mM EDTA）
  • 水       
    • 我们不建议在水中长期储存。

• Twist recommends storing Resuspended DNA:
  • Room temperature for 3 months
  • 4° C for 12 months
  • -20° C for 24 months
  • -80° C for long term storage

在订购克隆基因时，用户可在结账时选择整数质量的 DNA 作为其质粒制备的一部分进行交付。质量会自动测量并确保用户获得准确质量。If we don't hit the required mass in a single prep, we perform additional preps until we hit the required mass.

目前，基因片段（线性双链 DNA）最大为 5 kb。The maximum size for a clonal gene (a gene cloned into a vector) is 7 kb.

Twist 的 DNA 产品经干燥后，装入 96/384 孔板或 2 mL 微量离心管中。尽管双链 DNA 在大多数标准存储条件下都呈稳定状态，但我们建议您采用以下方法来保持 DNA 的高品质：

• 收到产品后，将试管或孔板短暂进行离心，并将 DNA 在 pH 8.0 的无核酸酶 Tris-EDTA (TE) 缓冲液或 pH 8.0 的 10 mM Tris-HCl 中重悬至所需浓度。
• 我们不建议在水中重悬。
• 建议储备溶液的浓度至少为 10 ng/uL，但最佳浓度需要根据您所需的应用来确定。
• 制备原液和工作溶液并将两者分装，以防止发生污染并减少冻融的次数。
• 若要长期储存，将 DNA 置于 -20°C 温度下冰冻长达一年，或在 -80°C 温度下冰冻更长时间。

请点击此处查看重悬指南。

基因产品通常以干燥产品的形式交付（除非另有规定）。

克隆基因需被克隆到 Twist 的目录载体或者客户的定制载体中，然后才能交付。基因片段以线性双链序列的形式交付（无论有或没有侧翼接头）。

我们通过 96/384 孔板来交付基因序列。对于小批量订单（少于 10 个），基因可通过试管来交付，无需支付额外费用。对于 10 个及以上基因的订单，根据试管订购要求，每个订单需额外支付 50 美元。

Twist Bioscience 保证公司遵守美国科技政策办公室 (OSTP) 核酸合成筛选框架的所有要求。

Clonal genes have a minimum guaranteed yield of 1 ug. 在少数情况下，序列经过 NGS 确认后，我们可能仍然无法满足最低收率，但我们仍然会发运我们能够回收的所有物料。

对于这些构建体，其收率将显示为“NA”。您可以尝试通过转化为细菌来挽救该构建体（要获得更多信息，请联系客户支持部）。对于不符合最低收率的构建体，将不会收取您的费用。

• Gene Fragments (with or without adapters): 2-4 个工作日
• 克隆基因：
  • Low/Medium Complexity : 10 business days (standard shipping) 4-7 business days (express shipping).
  • High Complexity 10 - 15 business days (Standard; Express not available)

为了确保生产过程不受牛传染性疾病的影响，Twist 在整个克隆、转化、扩增和纯化过程中提供使用非动物源性材料生产的纯化 DNA 构建体。

We only have SDS documents for NGS products on our website.  For SDS documents for our Synthetic Biology products, please email us at customersupport@twistbioscience.com.

登录账户后，您可以下载任何订单的孔板排列信息。

在主页中，点击“订单和草稿”，然后点击“过往订单”，将显示您所有的 Twist 订单。点击目标订单，在“已交付”选项卡上将显示可以下载孔板排列信息的链接。

目前，我们基因合成产品（基因片段或克隆基因）最小长度为 300 bp。

基因片段组装后通过片段分析检查其大小和纯度，但未经过序列验证。因此，基因片段为非克隆片段（即为完美和非完美材料的混合）。如果您计划克隆片段，则必须筛选多个克隆。片段的大小可能从长度 300 至 5,000 bp 不等。

相反，克隆基因先被组装，然后克隆到定制载体或 Twist 的目录载体之一。然后对克隆进行 NGS 序列验证，以确认发运和交付的仅为所需的序列。Clonal Genes can range in size from 300 to 7,000 bp in length.

对于基因片段，我们保证每个片段收率为 100-1000 ng。

对于克隆基因，有各种收率选项可选：

• 微量制备：每个克隆 1 µg - 4 µg
• 小量制备：每个克隆 4 µg - 10 µg
• 中量制备：每个克隆 10 µg - 100 µg
• 大量制备：每个克隆 100 µg - 1 mg

收率因您的序列（以及克隆基因的载体）而异，可能会更低。如果收率低于正常值，可能会因收率过低而导致基因合成失败。请注意，由于收率过低而合成失败的序列仍会交付，但不会收取您的费用。此外，还提供用于小规模制备的定制目标收率。

我们更新后的上传工具专为最大灵活性而设计。您可以上传包含序列名称和序列本身的 Excel 模板或 CSV 文件。

自动检测：算法会自动检测您的序列是 DNA 格式还是氨基酸格式。

灵活映射：系统会自动识别孔位、板以及自定义孔板布局等列信息。

上传后编辑：如果您的文件不包含位置数据，请不要担心——您可以在文件上传后直接在界面中指定孔位和板信息。

对于标准复杂度序列，并且考虑到我们的错误率为 1/7500，如图所示，选择推荐的菌落数量时找到具有正确序列的菌落的成功率为 95%。

请注意，该建议只是一个起点。各种因素（如载体类型、序列复杂性和序列内容）都会影响菌落生长。在某些情况下，可能需要选择 2 到 3 倍的推荐菌落数量。

对于接头打开的基因片段，会将通用接头合成至每个片段的两端。接头长度为 21-22 个核苷酸。具有这些接头的片段与多种组装方法兼容，即限制性酶切/连接、通路、Golden Gate 和 TOPO 克隆。

通过在接头内部添加限制性位点可移除接头。TOPO 克隆将发挥作用，但接头会保持打开状态。

接头序列

• 2021 年 8 月 9 日之前收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：GAAGTGCCATTCCGCCTGACCT
  • 3' 接头：AGGCTAGGTGGAGGCTCAGTG

• 2021 年 8 月 9 日至2021 年 11 月 1 日收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：CCCCGTCACCTTTGGCTTATCAGT
  • 3' 接头：AGTGACATCTGGACGCTAAGACCG

• 2021 年 11 月 2 日及之后收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：CAATCCGCCCTCACTACAACCG
  • 3' 接头：CTACTCTGGCGTCGATGAGGGA

Adapters are short sequences added to each end of the insert as part of our synthesis process. 在检验过程中也可获得不含这些接头的基因片段。

If you have any questions about your order, please contact us at customersupport@twistbioscience.com. 

是，基因片段经过磁珠清洁；然而，可能残留少量的短片段。

• 2021 年 8 月 9 日之前收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：GAAGTGCCATTCCGCCTGACCT
  • 3' 接头：AGGCTAGGTGGAGGCTCAGTG
  • 5' – GAAGTGCCATTCCGCCTGACCT – insert – AGGCTAGGTGGAGGCTCAGTG – 3'

• 2021 年 8 月 9 日至2021 年 11 月 1 日收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：CCCCGTCACCTTTGGCTTATCAGT
  • 3' 接头：AGTGACATCTGGACGCTAAGACCG
  • 5' - CCCCGTCACCTTTGGCTTATCAGT – insert – AGTGACATCTGGACGCTAAGACCG - 3'

• 2021 年 11 月 2 日及之后收到的订单，接头序列如下：
  • 5' 接头：CAATCCGCCCTCACTACAACCG
  • 3' 接头：CTACTCTGGCGTCGATGAGGGA;
  • 5' - CAATCCGCCCTCACTACAACCG – insert – CTACTCTGGCGTCGATGAGGGA - 3'

Adapters are short sequences added to each end of the insert as part of our synthesis process. 在检验过程中也可获得不含这些接头的基因片段。

如果您对订单有任何问题，请联系我们：{{[email protected]}}customersupport@twistbioscience.com

您可以单击此处，在您的账户中找到基因片段产品的定价表。

如果您需要联系客户经理了解定价事宜，可以在电子商务中的“账户”下找到其联系信息。

您可以借助以下方法，使用接头克隆基因片段：

酶切/连接——将限制性位点置于 Twist 接头内，以便克隆

Type IIS or Golden Gate - place restriction sites inside of the Twist adapters for easy cloning;  TOPO cloning (blunt-end) - the adapter sequences will be cloned in as well

Gateway 克隆——在您的序列两端增加 attB 位点

我们可为已完成的订单提供分析证书（COA）。您可以单击此处，在您的账户中找到基因片段产品的分析证书。

可以，每个基因需要额外收费 10 美元。

Twist can clone gene synthesis products of up to 7,000 bp into any of our catalog vectors. 我们还支持克隆到您自己的定制载体中。

Twist 提供的唯一包含 Kozak 序列的载体是 pTwist ENTR Kozak。Twist 提供的所有剩余的克隆、表达和抗体骨架载体均不包含 Kozak 或信号肽（前导）序列。Twist 建议，当计划在哺乳动物表达系统中表达蛋白质时，要包括 Kozak（GCCGCCACC 或变异）和信号序列。

否，目前 Twist 没有在植物中表达的载体；然而，只要它达到我们的要求，我们就可以存储定制载体。

您可以单击此处，在您的账户中找到克隆基因产品的定价表。

如果您需要联系客户经理了解定价事宜，可以在电子商务中的“账户”下找到其联系信息。

我们可为已完成的订单提供分析证书（COA）。您可以单击此处，在您的账户中找到克隆基因产品的分析证书。

重复结构、极端 GC 含量和均聚物是合成问题的主要影响因素。我们使用机器学习方法来确定成功概率。因此，在大多数情况下，序列排斥的原因并非单一。相反，复杂性或排斥源于多种特征的结合，这些特征共同导致了序列的复杂性。唯一的硬性规定如下：

• 避免均聚物 >= 14 bp

• 请勿包括 CcdB（II 型毒素-抗毒素系统）

如果遇到问题，我们建议删除或减少重复、极端 GC 含量的区域和均聚物。如果您的序列复杂、无法构建或包含与我们的内部流程相冲突的序列，我们将强调需要关注的区域。

我们的网站将接受氨基酸序列，并将其转化为 DNA 序列之后进行合成。请在“上传序列”页面中选择“氨基酸序列”选项。

请确保您输入的仅包含氨基酸单字母字符。我们仅支持标准的 20 个单字母代码字符。

氨基酸序列末尾的“*”表示终止密码子（我们不会自动添加终止密码子）

将根据您选择的密码子使用频率表，选择最常用的密码子。

如果您未找到所需的特定生物体，请联系 customersupport@twistbioscience.com 获得帮助。

克隆基因注意事项：并非所有的 Twist 表达载体在插入点上游都含有标准表达机制。我们建议您在选择需要的载体后，点击“下载序列”，再次检查最终质粒构建体的序列。

在我们的网站上提交您的基因序列后，将自动对基因序列进行组装可行性评分：

标准： 未发现错误。基因序列的总体复杂程度（如长度、GC 含量、同源性等）为“标准”。

复杂： 未发现错误。存在一些序列复杂性（如长度、GC 含量、同源性等），但我们预计在合成您的基因时不会出现任何问题。在极少数情况下，序列可能会有周转时间增加或制造失败的风险。

错误：基因序列存在错误。请单击序列，详细了解如何解决存在的错误。

不可接受： 该序列包含的元素会导致我们无法合成。请参阅错误信息提供的详细说明，或参考设计指南。

关于评分系统

我们的评分系统利用机器学习模型分析并结合多个序列参数（即总 GC 百分比、最大均聚物长度、最大重复长度、序列长度、重复密度等）。该模型使用我们的历史制造数据进行打磨，它可以更精确地估计基因和抗体产品的生产成功率

关于 ISSUE 信息

警告：经机器学习模型预测，与失败的风险相关。警告次数越多，越有可能导致“不可接受”得分。

错误： 与基因复杂性无关，可以通过改正基因设计来进行修复

客户可以选择订购寡核苷酸池、基因片段和克隆基因。

寡核苷酸池中的寡核苷酸（线性单链 DNA）大小范围为 20 - 300 bp。

基因片段为线性双链 DNA，其大小范围为 300 - 5,000 bp。

克隆基因为双链 DNA，已经被克隆到 Twist 的载体或客户提供的定制载体中。克隆基因大小范围为 300 - 5,000 bp。

Express Genes are Clonal Genes produced faster using Twist's Express service. 加急服务可按如下所示缩短生产时间，且不会影响任何阶段的质量。*

• 1 μg - 4 μg 和 4 μg - 10 μg DNA 级别：标准：10 business days; Express: 4-7 个工作日
• 10 µg - 100 µg 和 100 µg - 1 mg DNA 级别：标准：13 business days; Express: 7 - 10 个工作日

Express is available for Low and Medium complexity sequences

*条款和条件：基于丰富的生产经验，快速克隆基因服务的宣传交付时间是 4-7 个工作日。您的生产时间可能因序列而异。国际订单可能需要更长的运输时间。“加急基因”费用根据提交订单时芯片的容量而定，并且会有所波动。

通过我们的加急服务订购克隆基因可确保订单在每个生产阶段都获得最高优先级。通过专门用于我们的新服务级别的额外资源，此优先方法使我们能够在不影响质量的情况下加快克隆基因的生产。

不包括，广告的周转时间是生产“加急基因”所需的时间。

所有克隆基因（加急和标准）均使用隔夜或优先服务运送。

按地区划分的典型运送时间如下：

• 北美洲：1-2 个工作日
• 欧洲：2-3 个工作日
• 亚洲：2-4 个工作日
• 南美洲：3-6 个工作日

与甘油原液一起订购的加急基因以及 10 µg - 100 µg 和 100 µg - 1 mg DNA 级别的加急基因（即重悬 DNA）使用干冰运送，这可能会导致总周转时间增加 1 个工作日。

可能延迟运输和交付的一般考虑因素包括：

• 付款方式的问题
• 特定国家/地区的进口要求
• 生物安全序列筛选

不包括，“加急基因”之前需要加入新的定制载体。New Custom Vector Onboarding will take approximately 2 weeks. 

有关定制载体存储的更多信息，请参阅我们的常见问题解答链接，以获取更多信息。

加急基因有以下 DNA 制备大小：1 μg - 4 μg、4 μg - 10 μg、10 μg - 100 μg 和 100 μg - 1 mg。

周转时间随着制备大小的增加而增加，如下所示：1 μg - 4 μg 和 4 μg - 10 μg 需 4 - 7 个工作日，而 10 μg - 100 μg 和 100 μg - 1 mg 需 7 - 10 个工作日。

标准基因和加急基因具有相同的送货格式选项。

Clonal Gene sequences scored as "Low" or "Medium" complexity are eligible for the Express service. The Twist Bioscience eCommerce platform will score all sequences once they are uploaded and flag which ones are eligible for the Express service.

我们通过三级评分体系来判断您的基因的可制造性及所需交付周期：

• 低复杂度：标准设计，生产可预测，交付周期最快。
• 中等复杂度：需要额外生产预防措施但不需要更改您的序列的设计。
• 高复杂度：高度复杂的设计，需要专门的工作流程和更长的交付周期。

修改：如果您的序列超出了我们的复杂度参数、太长/太短或包含非标准字符，则会出现此状态。

如果序列符合以下任一标准，我们的算法会将序列标记为高复杂度：

• GC 含量：50 bp 窗口内的局部 GC 含量低于 10% 或超过 90%。
• 重复：直接重复序列 >200 bp；短串联重复序列（STR）>100 bp。
• Secondary Structures: Hairpin-forming repeats >100 bp.
• Homopolymers: Any single-nucleotide run (A, T, G, or C) >30 bp.
• 长度：300 bp 至 7000 bp 之间触发上述标记的任何序列。

注：对于中等和高复杂度序列，我们的网站现在会显示特定的警告标识，让您准确了解是哪些序列特征导致了复杂度评分的升高。

加急服务是克隆基因服务的升级版，其周转时间比标准服务更短。

High complexity sequences often require more production time to synthesize and clone, and therefore, will require additional manufacturing precautions and TAT speed.

“加急基因”服务采用动态定价来确保始终可用和可靠的准时交付，尤其是在高需求时期。每当价格发生变化时，都会反映在我们的电子商务平台上。

We continue to offer Clonal Genes produced with our Standard speed of service, which has a 10 business day turnaround time.

合同定价将反映在每个基因的基本价格中，并且加急服务费作为相对于合同基本价格的单独行项目添加。

Twist 致力于提供尽可能最佳的体验。如果“加急基因”交付延迟，加急服务费将享受 100% 折扣，并且您将按标准克隆基因价格开具发票。该保单的条款和条件请参见此处。

此外，我们还通过我们的 Twist 满意度政策为加急基因提供支持。如果您对加急基因不满意，请在下订单后三十 (30) 天内告知我们。

Only "Low" and "Medium" complexity sequences are eligible for the Express service. If a gene sequence is grayed out under the Express Genes section, that means it is a "High" Complexity or needs to be modified (score appears as "Modify") sequence and will be marked as such in the eCommerce platform.

是的，在电子商务上配置项目时的最大限制是 1,152 个“加急基因”。如果您计划订购超过 1,152 个“加急基因”，请联系客户支持以获取提交订单的帮助。

这表明我们已达到当前“加急基因”运行的最大容量。“加急基因”每天运行多次，请稍后回来查看。

High complexity sequences often require more production time to synthesize and clone, and therefore, will require additional manufacturing precautions and TAT speed.

We have moved beyond simple codon frequency tables. Our new algorithm prioritizes biological expression by focusing on:

• mRNA Stability
• Secondary Structure
• Ribosome Processivity

我们将可制造性参数与核心优化过程解耦，以优先聚焦于蛋白表达。然而，如果算法无法找到可合成的解决方案，它会自动尝试修复局部区域的极端复杂性问题。我们在进行此操作时会尽量将对表达谱的影响降至最低。

Important: 虽然我们致力于优化最佳的 DNA 组成，但请记住，蛋白表达受多种因素影响；DNA 序列只是影响您最终产量的众多变量之一。

目前，我们无法合成评级为“不可能”的基因。导致我们的算法将基因评级为“不可能”的因素有多种，而每个基因序列的具体参数是唯一的。我们的算法为专有算法，是利用机器学习开发的。除机器学习外，我们的算法还考虑了以下因素：

• GC 百分比在 25%-65% 之间
• 最大均聚物长度 <10
• 低同源性

以上因素的任意独特组合会导致特定基因序列被评为“不可能”。

Twist supports over 150 organisms, including most frequently used organisms such as E. coli, human, CHO, mouse and yeast.

We have moved beyond simple codon frequency tables. Our new algorithm prioritizes biological expression by focusing on:

• mRNA Stability
• Secondary Structure
• Ribosome Processivity

我们将可制造性参数与核心优化过程解耦，以优先聚焦于蛋白表达。然而，如果算法无法找到可合成的解决方案，它会自动尝试修复局部区域的极端复杂性问题。我们在进行此操作时会尽量将对表达谱的影响降至最低。

重要提示： 虽然我们致力于优化最佳的 DNA 组成，但请记住，蛋白表达受多种因素影响；DNA 序列只是影响您最终产量的众多变量之一。